Bioprinting คืออะไร?
Bio 3D Printing คือการพิมพ์ 3 มิติที่ใช้กับวัสดุในกลุ่มชีวภาพ ซึ่งมักจะมีส่วนประกอบหรือสภาวะที่คล้ายคลึงกับสิ่งมีชีวิต ต่างจากเทคโนโลยีอื่นที่มักใช้พลาสติก เรซิน หรือโลหะ โดยการพิมพ์จะสร้างโครงสร้างจำลองขึ้นมา ส่วนใหญ่จะเป็นโครงสร้างรองรับ (Scaffold) หรือในบางเทคนิคจะขึ้นรูปเซลล์เป้าหมายโดยตรง (Freeform reversible embedding of suspended hydrogels, Fresh) โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อให้เซลล์เป้าหมายสามารถเจริญเติบโตต่อไปได้
ข้อดีของเทคโนโลยีนี้คือสามารถขึ้นรูปเป็นโครงสร้าง 3 มิติ เพื่อเลียนแบบหรือออกแบบให้เหมาะสมที่สุดกับเซลล์แต่ละชนิด ดังนั้นการศึกษาและวิจัยในองค์ความรู้ด้านนี้จึงครอบคลุมตั้งแต่รูปแบบโครงสร้างที่เหมาะสม การเลือกใช้วัสดุในการขึ้นรูปโครงสร้าง รวมไปถึงเทคนิคการพิมพ์แบบต่างๆ ที่เหมาะสม บทความนี้เน้นไปที่การพิมพ์ชีวภาพ 3 มิติด้วยเทคโนโลยี Materials Extrusion เป็นหลัก โดย Bioprinting 101 จะกล่าวถึงภาพรวมของการทำงานเกี่ยวกับเทคโนโลยีนี้ว่าต้องคำนึงถึงปัจจัยใดบ้างและมีขอบเขตการทำงานอย่างไร
#1 พื้นฐานการพิมพ์ชีวภาพ 3 มิติ
การเลือกประเภทของเซลล์
ประเภทของเซลล์ หรือ Cell Line คือสิ่งที่กำหนดขั้นตอนการทำงานหลังจากนี้ทั้งหมด ในกลุ่มเนื้อเยื่อ ผิวหนัง หรือเส้นกล้ามเนื้อ เซลล์สามารถเติบโตในโครงสร้างที่แข็งแรงและเหมาะสมได้ ในขณะที่เนื้อเยื่อกลุ่มเส้นประสาทจะเติบโตได้ยากกว่ามาก ดังนั้นการศึกษาต้องคำนึงถึงการใช้งานจริงหรือการทดลอง รวมไปถึงแหล่งกำเนิดเซลล์ว่ามาจากมนุษย์หรือแหล่งอื่น ซึ่งมีความแตกต่างกันในรายละเอียด โดยส่วนใหญ่เซลล์มักจะใช้ควบคู่ไปกับสมบัติของ Bioink ที่เลือกใช้
ประเภทของ Bioinks
Matrix Ink เป็นส่วนสำคัญมาก ทำหน้าที่รองรับและเป็นที่ยึดเกาะของเซลล์ ส่วนใหญ่มักใช้กลุ่มไฮโดรเจลที่มีส่วนผสมหลักคือน้ำ Matrix Ink มีให้เลือกหลากหลายชนิดซึ่งมีข้อดีและข้อด้อยแตกต่างกันออกไป ทั้งนี้ยังมีตัว Reagents ที่ช่วยลบจุดอ่อนของเจลแต่ละชนิด ตัวอย่างการใช้งานดังตาราง
Support Ink
เป็นวัสดุกลุ่ม Biocompatible ที่มีความแข็งแรงมากกว่า Matrix Ink จึงได้ชื่อว่าเป็น Support มักมีน้ำเป็นส่วนประกอบ จึงมีความยืดหยุ่นและขึ้นรูปเป็นโครงสร้างได้ยาก ดังนั้นส่วนใหญ่จึงใช้ในการรองรับส่วนที่เป็นเนื้อเยื่อแข็ง ตัวอย่างการใช้งานเช่น กระดูก กล้ามเนื้อ เป็นต้น
Sacrificial Inks
วัสดุชีวภาพอื่นๆ ที่มักใช้เพื่อสร้างสภาวะที่ใกล้เคียงกับระบบชีวภาพจริง Support Baths เป็น support ที่เตรียมไว้เพื่อรองรับการพิมพ์ตามขนาดของโมเดลที่ต้องการ ต่างจาก Sacrificial Inks ตรงที่เป็นการพิมพ์ลงในตัว support เลย ไม่ได้เป็นการพิมพ์ตัว Support ขึ้นมาขณะพิมพ์ชิ้นงาน
Additive
การที่เซลล์ถูกเลี้ยงไว้ในไบโออิงค์ช่วยให้เซลล์สามารถเจริญเติบโตและปรับเปลี่ยนโครงสร้างชีวภาพที่พิมพ์ขึ้นให้กลายเป็นเนื้อเยื่อที่มีชีวิตได้ การใช้ไบโออิงค์ที่มีโปรตีนเฉพาะของเนื้อเยื่อแต่ละชนิดจะช่วยเพิ่มความจำเพาะและสามารถปรับแต่งให้เหมาะสมกับการใช้งานเฉพาะด้านได้ โปรตีน เช่น vitronectin หรือ fibronectin มีบทบาทในการควบคุมพฤติกรรมของเซลล์ เช่น การยึดเกาะ การเคลื่อนที่ การแบ่งตัว และการเปลี่ยนแปลง รวมถึงการมีปฏิสัมพันธ์กับคอลลาเจน เฮปาริน และ GAGs (glycosaminoglycans)
Photoinitiators
หนึ่งในสารเคมีที่ช่วยให้เกิดการเชื่อมขวาง (Crosslink) ของวัสดุ เพื่อเพิ่มความแข็งแรงของโครงสร้าง โดยใช้พลังงานแสงหรือคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้า (electromagnetic radiation) กระตุ้นให้เกิดปฏิกิริยา ทั้งนี้แต่ละชนิดจะใช้ความยาวคลื่นแตกต่างกัน
การสร้างแบบจำลอง 3 มิติ
ก่อนที่จะพิมพ์วัตถุด้วยเทคโนโลยี 3D printing เราจำเป็นต้องทราบรูปร่างและลักษณะของวัตถุนั้นก่อน ไม่ว่าจะเป็นวัตถุที่มีรูปทรงง่ายๆ ไม่ซับซ้อน เช่น กระบอกทดสอบ หรือโครงข่ายหลอดเลือดที่ซับซ้อน ขั้นตอนแรกมักเริ่มจากการสร้างโมเดลสามมิติ จากนั้นแปลงโมเดลดังกล่าวเป็นไฟล์ STL และต่อด้วยการแปลงไฟล์ STL เป็นไฟล์ G-code ซึ่งเป็นคำสั่งที่เครื่องพิมพ์ใช้แปลความเป็นคำสั่งเคลื่อนที่ของมอเตอร์ ในส่วนนี้จะกล่าวถึงวิธีการเปลี่ยนไอเดียของวัตถุที่ต้องการพิมพ์ให้กลายเป็นไฟล์ STL ผ่านการออกแบบโมเดลด้วยตนเอง
การออกแบบโมเดลด้วยตนเอง
มีโปรแกรมมากมายที่ช่วยให้ผู้ใช้สามารถออกแบบโมเดลสามมิติได้ด้วยตนเอง ซึ่งมักเรียกกันว่าโปรแกรม CAD (Computer Aided Design) เช่น SolidWorks, Inventor และ AutoCAD เป็นต้น ข้อดีของการออกแบบโมเดลด้วยตนเองคือการควบคุมรูปร่างและรายละเอียดของโมเดลได้อย่างเต็มที่ เมื่อออกแบบเสร็จแล้วสามารถบันทึกไฟล์ CAD เป็นไฟล์ STL เพื่อเตรียมเข้าสู่ขั้นตอนการสไลซ์ (slicing) ต่อไป
การแปลงจากภาพทางการแพทย์
อีกวิธีหนึ่งที่นักวิจัยนิยมใช้คือการแปลงข้อมูลภาพทางการแพทย์ เช่น การสแกน CT ให้กลายเป็นไฟล์ STL โดยทั่วไปภาพ CT เป็นประเภทที่ใช้กันมากที่สุด แต่ภาพทางการแพทย์อื่น ๆ ที่บันทึกในรูปแบบ DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) ก็สามารถนำมาใช้ได้เช่นกัน กระบวนการแปลงนี้ใช้ซอฟต์แวร์ที่แปลความเข้มแสงในภาพเป็นชนิดของเนื้อเยื่อและกำหนดขอบเขตระหว่างเนื้อเยื่อต่าง ๆ โปรแกรมยอดนิยมได้แก่ Mimics, 3D Slicer และ InVesalius 3 ข้อดีของวิธีนี้คือโมเดลที่ได้มีความเกี่ยวข้องและสอดคล้องกับสภาพทางคลินิกจริง
การใช้ฐานข้อมูลโมเดล
หากไม่มีข้อมูลภาพทางการแพทย์ สามารถใช้ฐานข้อมูลที่มีไฟล์ STL ที่แปลงมาจาก DICOM ได้ โดยหลายสถาบันการศึกษาและองค์กรเอกชนมีคลังข้อมูลและข้อตกลงการใช้สิทธิ์ให้เลือกใช้งาน ตัวอย่างฐานข้อมูลที่น่าสนใจ เช่น
สำหรับไฟล์ชีวการแพทย์ (Biomedical STLs): Allevi print files, Biomodel BioCAD, Embodi3d, BodyParts 3D
สำหรับไฟล์ทั่วไป (General STLs): Thingiverse, TinkerCAD
ตัวแปรในการขึ้นรูปด้วยการพิมพ์ 3 มิติ
วัสดุแต่ละชนิดที่ใช้ในงานพิมพ์ชีวภาพสามมิติจำเป็นต้องตั้งค่าการพิมพ์ที่เหมาะสมเพื่อให้ได้การฉีดออกที่ดีและเส้นพิมพ์ที่คมชัด พารามิเตอร์เหล่านี้ส่งผลทั้งในระดับจุลภาค เช่น ความมีชีวิตของเซลล์ และในระดับมหภาค เช่น ขนาดรูพรุนและความคงรูปของโครงสร้าง
พารามิเตอร์การสไลซ์ (Slicing Parameters)
การสไลซ์คือกระบวนการแปลงไฟล์ STL เป็นไฟล์ G-code โดยต้องตั้งค่าระดับชั้น (layer height), ขนาดหัวฉีด (nozzle size), และความเร็วการพิมพ์ (print speed) โดยทั่วไป ความสูงของชั้นพิมพ์สัมพันธ์กับขนาดหัวฉีดเนื่องจากหัวฉีดมักมีหน้าตัดเป็นวงกลม ควรทราบว่าความเร็วการพิมพ์หมายถึงความเร็วของหัวฉีดที่เคลื่อนที่สัมพันธ์กับพื้นผิว ไม่ใช่อัตราการไหลของวัสดุที่ฉีดออก วัสดุแต่ละชนิดมีความหนืดแตกต่างกัน จึงจำเป็นต้องปรับพารามิเตอร์ให้เหมาะสม เช่น วัสดุบางชนิดมีความหนืดสูงและฉีดช้า จึงต้องใช้ความเร็วพิมพ์ต่ำ
ข้อจำกัดสำคัญของความละเอียดในการพิมพ์วัสดุชีวภาพคือขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางของเข็ม ความละเอียดจะดีขึ้นเมื่อใช้ความสูงชั้นพิมพ์ต่ำและความเร็วพิมพ์สูง แต่การฉีดจะง่ายขึ้นเมื่อใช้หัวฉีดขนาดใหญ่ ความสูงชั้นพิมพ์มาก และความเร็วพิมพ์ต่ำ การหาสมดุลระหว่างพารามิเตอร์เหล่านี้ถือเป็นขั้นตอนสำคัญในการเพิ่มอัตราสำเร็จในการพิมพ์ หลังจากนั้นมักเซฟเป็นนามสกุล G-Code เพื่อสั่งพิมพ์ในลำดับถัดไป
พารามิเตอร์เครื่องพิมพ์ (Printer Parameters)
เมื่อไฟล์ G-code พร้อมแล้ว จำเป็นต้องตั้งค่าการทำงานของเครื่องพิมพ์ให้เหมาะสมกับวัสดุที่ใช้ ในแพลตฟอร์ม Allevi ที่ใช้การฉีดด้วยแรงดันลม (pneumatic extrusion) พารามิเตอร์หลักได้แก่ ความดัน, อุณหภูมิ และการเชื่อมโยงข้าม (crosslinking)
เข็มฉีด (Needle)
ลักษณะของเข็มฉีด เช่น ขนาดเกจ ความยาว รูปทรง และวัสดุ มีผลต่อความดัน อุณหภูมิ และความเร็วที่ใช้ได้ แม้ว่าการเลือกเข็มที่เหมาะสมจะดูเหมือนชัดเจน แต่ควรใช้คู่มือการเลือกเข็มเพื่อพิจารณาปัจจัยต่าง ๆ อย่างรอบคอบ
#2 การเพาะเซลล์ (Cell Culture)
การเพาะเลี้ยงเซลล์คือกระบวนการเลี้ยงเซลล์ในสภาพแวดล้อมที่ควบคุมในห้องปฏิบัติการ ซึ่งเป็นขั้นตอนสำคัญในงานพิมพ์ชีวภาพสามมิติ เนื่องจากงานวิจัยต้องใช้เซลล์จำนวนมาก การเพาะเลี้ยงเริ่มต้นจากการสั่งซื้อเซลล์จากสายเซลล์ที่ต้องการศึกษา จากนั้นจึงเพาะเลี้ยงเซลล์ให้มีจำนวนเพียงพอสำหรับการทดลอง โดยในไบโออิงค์ที่มีเซลล์ผสมอยู่ ความเข้มข้นของเซลล์อาจอยู่ในช่วง 1-10 ล้านเซลล์ต่อน้ำหนักไบโออิงค์ 1 มิลลิลิตร ซึ่งการทดลองพิมพ์หนึ่งครั้งอาจต้องใช้เซลล์ถึง 50 ล้านเซลล์ หลังจากพิมพ์เสร็จ การดูแลรักษาสภาพแวดล้อมที่เหมาะสมและเป็นมิตรกับเซลล์ในโครงสร้างที่พิมพ์ขึ้นก็เป็นสิ่งสำคัญ เพื่อสังเกตการเจริญเติบโตและความอยู่รอดของเซลล์ในระยะยาว
#3 การวางแผนโครงการระยะยาว
โครงการพิมพ์ชีวภาพมีความซับซ้อนและหลากหลาย การเริ่มต้นและกำหนดข้อมูลที่ต้องใช้เพื่อดำเนินงานให้สำเร็จอาจเป็นเรื่องสับสน โครงการแต่ละโครงการมีเป้าหมายและขั้นตอนที่แตกต่างกัน แต่โดยทั่วไปสามารถแบ่งโครงการออกเป็นสามประเภทหลักตามวัตถุประสงค์ ดังนี้
โครงการด้านชีววิทยา (Biological Project) มุ่งเน้นการศึกษาปรากฏการณ์ทางชีวภาพหรือทดสอบการตอบสนองทางชีวภาพในสถานการณ์การเพาะเลี้ยงสามมิติ
โครงการด้านวัสดุศาสตร์ (Material Project) มุ่งเน้นการศึกษาคุณสมบัติของวัสดุชีวภาพ เช่น การทดสอบประสิทธิภาพของไบโออิงค์ชนิดใหม่ หรือพัฒนาการใช้งานวัสดุที่มีอยู่แล้วในทางชีวภาพ
โครงการด้านการประยุกต์ใช้ (Application Project) มุ่งเน้นการสาธิตเทคนิคการพิมพ์ชีวภาพใหม่ โดยใช้วัสดุและองค์ประกอบทางชีวภาพที่ได้รับการศึกษามาแล้ว เพื่อเน้นความแปลกใหม่ของวิธีการหรืออุปกรณ์ใหม่
นอกจากนี้ โครงการพิมพ์ชีวภาพยังสามารถแบ่งออกเป็นช่วงต่าง ๆ ที่สอดคล้องกับด้านชีววิทยา ความสามารถในการพิมพ์ และกระบวนการพิมพ์จริง
เฟส A และ B
เฟส A และ B เป็นเฟสที่มีความยืดหยุ่นและมักสามารถดำเนินการควบคู่กันได้ เฟส A มุ่งเน้นการทดลองด้านชีววิทยาพื้นฐานของโครงการพิมพ์ชีวภาพ ขณะที่เฟส B มุ่งเน้นการทดลองด้านวัสดุศาสตร์
เป้าหมายของเฟส A
ยืนยันว่าคุณได้เลือกสายเซลล์ที่เหมาะสมและสามารถเพาะเลี้ยงได้ ตรวจสอบว่าเซลล์ของคุณสามารถอยู่รอดได้ในกระบวนการเก็บเกี่ยว การเพาะเลี้ยงก่อนการพิมพ์ และการถูกนำไปสร้างเป็นโครงสร้างชีวภาพ (ทั้งแบบพิมพ์โดยตรงหรือหว่านเซลล์ภายหลัง) แสดงให้เห็นว่าเซลล์ที่เลือกสามารถอยู่รอดเมื่อสัมผัสกับไบโออิงค์ที่เลือก โดยเฉพาะในระยะเวลานาน เป้าหมายของเฟส B
ตรวจสอบว่าไบโออิงค์ที่เลือกสามารถใช้งานร่วมกับเครื่องพิมพ์ได้ เช่น ในกรณีของเครื่องพิมพ์ Allevi ต้องมั่นใจว่าวัสดุนั้นสามารถฉีดออกจากกระบอกฉีดด้วยแรงดันลมได้
กำหนดพารามิเตอร์การพิมพ์ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับวัสดุที่เลือก โดยปรับแต่งตามเป้าหมาย เช่น ความมีชีวิตของเซลล์ ระยะเวลาการพิมพ์ ความคงรูปของโครงสร้าง ฯลฯ ยืนยันว่าวัสดุที่เลือกมีคุณสมบัติทางกายภาพที่เหมาะสมสำหรับโครงสร้างชีวภาพในขั้นตอนถัดไป
เฟส C และ D
เฟส C และ D มุ่งเน้นการพิมพ์จริงและการทดลองขั้นสูง ขณะที่เฟส A และ B เป็นการวางรากฐาน
เป้าหมายของเฟส C
ออกแบบและพิมพ์โครงสร้างที่มีความเกี่ยวข้องทางเรขาคณิต ดำเนินการเพาะเลี้ยงเซลล์ระยะยาว (โดยทั่วไป 14-21 วัน) ในหรือบนโครงสร้างที่พิมพ์ขึ้น แสดงให้เห็นว่าเซลล์มีพฤติกรรมที่สอดคล้องกับความต้องการทางชีวภาพในช่วงการเพาะเลี้ยง ขึ้นอยู่กับโครงการ เฟสนี้อาจเป็นช่วงที่แสดงจุดเด่นหรือความแปลกใหม่ของโครงการ ทั้งโครงการชีววิทยาและวัสดุศาสตร์จะมีขั้นตอนคล้ายกันในช่วงต้นของเฟส C ซึ่งเป็นเฟสแรกที่มีการพิมพ์ชีวภาพจริง โดยมักเริ่มจากการสร้างโครงสร้างที่มีเซลล์ฝังอยู่ในไบโออิงค์ หรือหว่านเซลล์ภายหลังการพิมพ์ การออกแบบโครงสร้างนี้จะเริ่มต้นหลังจากได้ไฟล์ออกแบบจากเฟส B โครงสร้างสุดท้ายอาจต้องปรับแต่งเพิ่มเติมเพื่อให้เหมาะสมกับการพิมพ์และมีความเกี่ยวข้องทางเรขาคณิต อาจรวมถึงการวิเคราะห์องค์ประกอบจำกัด (finite element analysis), การจำลอง CFD และการเปรียบเทียบกับอวัยวะหรือเนื้อเยื่อจริง
หลังจากพิมพ์เสร็จจะเริ่มเพาะเลี้ยงเซลล์ทันที นักวิจัยมักพิมพ์ตัวอย่างหลายชุดพร้อมกัน โดยมีชุดที่ไม่มีเซลล์เป็นตัวควบคุม และชุดที่มีเซลล์ซึ่งนำไปวิเคราะห์ในช่วงเวลาต่าง ๆ เช่น 3, 7, 14 และ 21 วัน ชุดที่ไม่มีเซลล์อาจใช้วิเคราะห์คุณสมบัติเรขาคณิตด้วยเทคนิคการถ่ายภาพ
หลังช่วงเพาะเลี้ยง นักวิจัยจะวิเคราะห์พฤติกรรมโดยรวมของเซลล์ และในบางกรณีจะวิเคราะห์คุณสมบัติทางกายภาพของโครงสร้างด้วย ผลการวิเคราะห์จะนำไปสู่ข้อสรุปเกี่ยวกับสมมติฐานของโครงการ หากประสบความสำเร็จ ผลลัพธ์เหล่านี้จะเป็นพื้นฐานของบทความวิชาการหรือทรัพย์สินทางปัญญา โครงการด้านการประยุกต์ใช้ก็จะรวมการทดลองในเฟส C ด้วย แต่ในบางกรณีอาจเน้นการตรวจสอบความถูกต้องมากกว่าการค้นพบใหม่
เป้าหมายของเฟส D
แสดงให้เห็นความแปลกใหม่ที่สำคัญของโครงการซึ่งยังไม่ได้รับการพิสูจน์ หลายโครงการจะรวมการทดลองในสัตว์ (in vivo) ด้วย แม้ไม่จำเป็นสำหรับทุกโครงการ เฟส D ประกอบด้วยการทดลองที่ซับซ้อนและท้าทายมากกว่าการทดลองในเฟส C หรือจากวรรณกรรมเดิม โดยมักเป็นการเปลี่ยนจากการทดลองในสภาพควบคุม (in vitro) ไปสู่สภาพแวดล้อมที่ซับซ้อนและมีความหมายมากกว่า (in vivo) เช่น การศึกษาการเปลี่ยนแปลงของโครงสร้างหลังการปลูกถ่าย หรือการตอบสนองของร่างกายต่อโครงสร้างนั้น การทดลองในเฟสนี้ต้องได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยในสัตว์ (IRB) และต้องคำนึงถึงจริยธรรมอย่างสูง นอกจากนี้ยังต้องพิจารณาวิธีนำเสนอผลการทดลองจากเฟส C ในบริบทที่มีความหมายมากขึ้น การวิเคราะห์หลังการทดลองมักคล้ายคลึงกับที่ใช้ในเฟส C
ที่มาของบทความ Bio 3D printing 101 Allevi Bioprinting 101 : Learn How to 3D Bioprint
